PENETAPAN KADAR HEMOGLOBIN

Hemoglobin dapat ditetapkan dengan berbagai cara, antara lain metode sahli, metode oksihemoglobin, atau metode sianmethemoglobin. Metode sahli tidak dianjurkan karena mempunyai kesalahan yang besar, alatnya tidak dapat distandarisasi, dan tidak semua jenis hemoglobin dapat ditetapkan sebagai contoh karboksihemoglobin, methemoglobin, dan sulfahemoglobin.

Hanya ada 2 metode yang dapat diterima dalam hemoglobinometri klinik, yaitu oksihemoglobin, dan sianmethemoglobin. Keduanya merupakan cara spektrofotometrik. Metode oksihemoglobin hanya mengukur semua hemoglobin yang dapat diubah menjadi oksihemoglobin, sedang karboksihemoglobin dan senyawa hemoglobin yang lain tidak terukur.

Internasional Committe for Standarization in Hematology (ICSH) merekomendasikan metode sianmethemoglobin, sebab selain mudah dilakukan juga mempunyai standar yang stabil dan hampir semua jenis hemoglobin terukur kecuali sulfahemoglobin.

1. Metode Sahli

a. Dasar

Metode sahli merupakan satu cara penetapan hemoglobin secara visual. Darah diencerkan dengan larutan HCl sehingga hemoglobin berubah menjadi hematin asam. Untuk dapat menentukan kadar hemoglobin dilakukan dengan mengencerkan larutan campuran tersebut dengan aquadest sampai warnanya sama dengan warna batang gelas standar.

b. Peralatan dan Pereaksi

• alat untuk mengambil darah vena atau darah kapiler


• hemometer sahli, yang terdiri atas
  
  
  
  • tabung pengencer. panjang 12cm, dinding bergaris mulai angka 2(bawah) s/d 22(atas)
  
  
  • dua tabung standar warna
  
  
  • pipet Hb. dengan pipa karet panjang 12,5 cm terdapat angka 20
  
  
  • pipet HCl
  
  
  • botol tempat aquadest dan HCl 0,1N
  
  
  • batang pengaduk (dari glass)
  
  
  • larutan HCl 0,1N
  
  
  
  


• aquadest

c. Spesimen

Dapat berupa darah kapiler atau darah vena (darah EDTA)

d. Cara Kerja

• isi tabung pengencer dengan HCl 0,1N sampai angka 2


• dengan pipet Hb, hisap darah sampai angka 20 mm, jangan sampai ada gelembung udara yang ikut terhisap


• hapus darah yang ada pada ujung pipet dengan tissue


• tuangkan darah ke dalam tabung pengencer, bilas dengan aquadest bila masih ada darah dalam pipet


• biarkan satu menit


• tambahkan aquadest tetes demi tetes, aduk dengan batang kaca pengaduk


• bandingkan larutan dalam tabung pengencer dengan warna larutan standar


• bila sudah sama penambahan aquades dihentikan, baca kadar Hb pada skala yang ada ditabung pengencer

e. Nilai Normal menurut Dacie

• dewasa laki-laki : 13,5 - 18,0 gr%


• dewasa wanita : 11,5 - 16,5 gr%


• bayi (< 3bln) : 13,6 - 19,6 gr%


• umur 1 tahun : 11,0 - 13,0 gr%


• umur 12 tahun :11,5 - 14,8 gr%

f. Sumber Kesalahan

• tidak semua hemoglobin berubah menjadi hematin asam seperti karboksihemoglobin, methemoglobin, sulfahemoglobin.


• cara visual mempunyai kesalahan inheren 15-30%, sehingga tidak dapat untuk menghitung indeks eritrosit.


• sumber kesalahan yang sering terjadi :
  
  
  
  • kemampuan untuk membedakan warna tidak sama
  
  
  • sumber cahaya yang kurang baik.
  
  
  • kelelahan mata
  
  
  • alat-alat kurang bersih
  
  
  • ukuran pipet kurang tepat, perlu dikalibrasi
  
  
  • pemipetan yang kurang akurat
  
  
  • warna gelas standar pucat / kotor dan lain sebagainya
  
  
  • penyesuaian warna larutan yang diperiksa dalam komparator kurang akurat.
  
  
  
  

2. Metode Oksihemoglobin

metode yang paling sederhana dan tercepat dalam fotometri. Tetapi keterandalan ini tidak dipengaruhi oleh kenaikan bilirubin plasma. Kerugiannya standar oksihemoglobin tidak stabil.

a. Dasar

Darah dicampur dengan larutan Natrium Karbonat 0,1% atau amonium hidroksida dan dikocok terjadi oksihemoglobin, intensitas warnanya diukur secara spektofotometrik.

b. Peralatan dan Pereaksi

• Na-Karbonat 0,1% atau NH4OH 0,04%


• pipet ukur 5 ml


• mikropipet 20 mikroliter


• tabung reaksi ukuran 75X10mm


• spektofotometer.

c. Cara Kerja

• siapkan tabung reaksi yang berisi 5 ml larutan Na-Karbonat 0,1%


• tambahkan EDTA atau Darah kapiler 20 mikro, bilaslah mikropipet yang digunakan, paling sedikit 3 kali.


• tutuplah tabung reaksi tersebut dan kocoklah 10 detik. baca serapan dengan spektrofotometri pada 540 nm


• baca kadar hemoglobinnya pada kuvet kalibrasi yang telah dipersiapkan sebelumnya.

3. Metode Sianmethemoglobin

a. Dasar

ferrosianida mengubah besi pada Hb dari bentuk ferro ke bentuk ferri menjadi methemoglobin yang kemudian bereaksi dengan KCN membentuk pigmen yang stabil yaitu sianmethemoglobin. Intensitas warna yang terbentuk yang diukur fotometrok 540 nm. Kalium-hidrogen-fosfat digunakan agar pH tetap di mana reaksi dapat berlangsung sempurna pada saat yang tepat. Deterjen berfungsi mempercepat hemolisa darah serta mencegah kekeruhan yang terjadi oleh protein plasma.

b. Peralatan dan Pereaksi

• mikropipet 20 mikroliter / mmk atau pipet Sahli


• pipet volumetrik 5 ml


• tabung reaksi ukuran 75 x 10mm


• spektrofotometer/kolorimeter dengan panjang gelombang 540 nm


• larutan Drabkin atau modifikasinya (diperdagangkan dalam bentuk kit), yang berisi kandungan :
  
  
  
  • kalium ferrosianida 200mg
  
  
  • KCN 50 mg
  
  
  • Kalium Hydrogen fosfat 140 mg
  
  
  • detergen 0,5-1 ml
  
  
  • aquadest / detenized water ad. 1000 ml
  
  
  
  

c. Spesimen

Darah kapiler atau darah EDTA

d. Cara Kerja

• ke dalam tabung reaksi 75 x 10 mm, pipetkan 5 ml pereaksi


• dengan mikropipet tambahkan 20mikroliter / mmk darah penderita ke dalam pereaksi tersebut serta hindarilah terjadinya gelembung dan bersihkan bagian mikropipet.


• campurkan isinya dan iarkan pada suhu kamar selama 3-5 menit dan serapannya dibaca dalam spektrofotometri pada panjang gelombang 540nm dengan pereaksi sebagai blangko


• kadar hemoglobin dapat dibaca pada kurva kalibrasi atau dihitung dengan menggunakan faktor; dimana kadar Hb = serapan x faktor kurva kalibrasi dan faktor telah dipersiapkan sebelumnya.

e. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Perhitungan faktor.

Sebelum fotometer dipergunakan untuk penetapan kadar hemoglobin, harus dikalibrasi dulu, atau dihitung faktornya. Untuk keperluan tersebut dipergunakan larutan standart hemisianida (sianmethemoglobin) dan pengenceran larutan tersebut dalam pereaksi Drapkin. Kadar Hb dari larutan standart hemisianida dapat dihitung dalam gr/100ml atau gr/dl sebagai berikut :

Kadar HbLarutan Standart =

Kadar hemisianida mg/dl 1000/100

X (500 + 20) mikroliter 20 mikroliter

= kadar hemisianida X 0,251 mg/dl

Buatlah pengenceran larutan standar 100, 75, 50, 25, dan 0% sebagai blanko dengan larutan Drapkin. Setelah masing-masing tercampur sempurna biarkan pada suhu kamar 3 menit dan baca serapan pada fotometer dengan 540 nm. Buatlah kurvanya dengan kadar Hb sebagai absisi dan serapan sebagai ordinat, maka hasil percobaan serapan pasien tinggi memplotkan pada kurva tera. Atau menggunakan factor sebagai berikut :

Faktor (F)

=

Jumlah Kadar Hb Jumlah Serapan

f. Pengawasan Mutu

Hemolisat yang dipergunakan atau dibuat sendiri dengan standar hemosianida, CV optimal = 3% dan CV tidak boleh lebih dari 6%

g. Sumber Kesalahan

• terjadinya jendalan darah


• darah yang hipemik menyebabkan hasilnya lebih tinggi dari seharusnya.


• leukositosis berat mempengaruhi pengukuran lebih rendah dari seharusnya


• kerusakan pereaksi


• pemipetan yang tidak akurat


• fotometer yang kurang baik