HITUNG TROMBOSIT

Metode untuk menghitung trombosit telah banyak dibuat dan jumlahnya tergantung dari kenyataan bahwa sukar untuk menghitung sel-sel trombosit yang merupakan partikel kecil dan mudah aglutinasi maupun mudah pecah. Sukar untuk membedakan dengan kuman. Metode elektronik mempunyai ketelitian yang baik, tetapi metode visual yang langsung cukup dapat digunakan utnuk menghitung trombosit yang rendah sampai tinggi. Bila trombosit rendah, maka metode yang menggunakan plasma cukup bermakna. Metode elektronik tidak akan diuraikan.Yang akan dibahas dalam halaman ini adalah penghitungan trombosit dengan metode langsung (Rees-Ecker).

a. Prinsip

Darah diencerkan ke dalam larutan yang mengandung brilliant cresyl blue, sehingga trombosit tercat biru muda. Trombosit dihitung dengan bilik hitung. Hasil pemeriksaannya diperiksa ulang dengan sediaan apus.

b. spesimen

Darah EDTA atau darh kapiler

c. Peralatan dan Pereaksi

• larutan pengencer trombosit (Rees-Ecker)
  
  
  
  • Natrium Sitrat 3,8 gr
  
  
  • brillian cresyl blue 0,1 gr
  
  
  • Formaldehid 40% 0,2 gr
  
  
  • Aquadest 100 ml
  
  
  • salinlah sebelum digunakan
  
  
  
  


• pipet eritrosit


• bilik hitung


• kaca Obyek, cat wright dan larutan penyangga fosfat


• mikroskop


• cawan petri


• kertas saring / tissue

d. Cara Kerja

hisaplah darah dengan pipet erotrosit sampai tanda 0,5 dan encerkan dengan larutan pengencer sampai tanda 101 (pengenceran 200x). Mulai saat ini trombosit harus selesai dihitung dalam waktu 30 menit, agar tidak terjadi disintegrasi sel-sel trombosit

kocoklah pipet tersebut 3-5 menit

bersihkan bilik hitung

siapkanlah cawan petri bagian dalam, dasar dan tutupnya ditempeli kapas yang ukurannya sama dan sebelumnya telah dibasahi air

setelah pipet tersebut dikocok, buanglah 4 tetes pertama dan tetesan ke lima isikan ke dalam bilik hitung. masukkan bilik hitung tersebut ke dalam cawan petri yang telah disiapkan tadi. Biarkan selama 15 menit , agar trombosit mengendap dan tidak terjadi penguapan.

letakkan bilik hitung di bawah mikroskop dengan perbesaran 100X obyektif dan kemudian perbesaran 40 x , trombosit tampak refraktif dan mengkilat berwarna biru muda / nila, lebih kecil dari eritrosit serta bentuk bulat, lonjong atau tersebar atau bergerombol.

perhitungan:

jumlah trombosit =

rata-rata jumlah trombosit tiap kotak X pengenceran volume kotak trombosit(kotak kecil)

buatlah sediaan apus dengan pewarnaan Wright dan amati kesan jumlah trombosit sebagai periksa ulang terhadap metode di atas

HITUNG JUMLAH RETIKULOSIT

Retikulosit adalah eritrosit muda yang sitoplasmanya mengandung sejumlah besar sisa-sisa ribosom dan RNA, dan berasal dari sisa inti dari bentuk penuh pendahulunya. Ribosom mempunyai kemampuan utnuk bereaksi dengan cat tertentu seperti briliant cresyl blue atau new methylene blue untuk membentuk endapan grnaula atau filament yang berwarna biru. Reaksi ini hanya terjadi pada pewarnaan terhadap sel yang masih hidup dan tidak difiksasi. Oleh karena itu disebut pewarnaan supravital. Retikulosit paling muda (imatur) adalah yang mengandung ribosom terbanyak. Sebaliknya retikulosit tertua hanya mempunyai beberapa titik rinosome. Banyak retikulosit dalam darah tepi menggambarkan aktivitas eritropoiesis yang hampir akurat. Hitung retikulosit dinyatakan sebagai prosentase jumlah retikulosit per 1000 eritrosit. Nilai normalnya 0,5 - 1,5 %.

a. Dasar

Darah dicampur dengan karutan brilliant cresyl blue atau larutan new methylene blue, lalu dibuat sediaan apus dan jumlah retikulositnya dihitung di bawah mikroskop. Jumlah retikulosit dihitung per 1000 eritrosit dan dinyatakan dalam %.

b. Peralatan dan Pereaksi

• pewarnaan retikulosit dapat dilakukan dengan salah satu cat berikut:
  
  
  
  • larutan new methylene blue :
    
    
    
    • Natrium Klorida 0,8 gr
    
    
    • Kalium Oxalate 1,4 gr
    
    
    • New methylen blue 0,5 gr
    
    
    • aquadest 100 ml
    
    
    
    
  
  
  • larutan brilliant cresyl blue :
    
    
    
    • brilliant cresyl blue 1,0 gr
    
    
    • Na sitrat 20 ml
    
    
    • Natrium Clorida 0,85% 80 ml
    
    
    
    
  
  
  
  


• saring kedua cat tersebut sebelum digunakan


• kaca obyek


• tabung reaksi kecil


• pipet pasteur atau tabung mikrohematokrit


• mikroskope

c. spesimen

darah kapiler , darah EDTA atau darah segar

d. Cara Kerja

• ke dalam tabung reaksi kecil tetskan 2btetes larutan brilliant cresyl blue dalam natrium citrat atau new methylene blue.


• tembahkan 4 tetes darah, campurkan baik-baik dan biarkan selama15 menit agar pewarnaan sempurna


• inkubasi 37 derajat Celcius selama 15 menit, tabung tersebut kocok sekali lagi dan ambil setetes dengan pipit pasteur untuk dibuatn sediaan darah apus. Keringkan di udara dan periksalah dengan mikroskop.


• periksalah dengan perbesaran obyektif 100 kali. Carilah daerah yang cukup tipis di mana eritrosit tidak membuat reuleaux. Eritrosit biru muda dan retikulasit akan tumpak sebagai sel yang mengandung granula / filament biru. Bila kurang jelas bisa di counterstain (dicat lagi) dengan cat wright


• hitung dalam 1000 eritrosit dengan mempersempit lapangan pandang (letakkan kertas dengan lubang di dalam okuler)

e. Perhitungan

jumlah retikulosit =

jumlah retulosit 1000 eritrosit

x 100 %

g. Nilai Normal Dacie ; 0,5 - 1,5 %

INDEKS ERITROSIT

MCV	Ht Jumlah eritrosit x 10	nilai normal 82 - 92 femtoliter
MCH	Hb Jumlah eritrosit x 10	nilai normal 27 - 32 pikogram
MCHC	Hb Ht x 100%	nilai normal 32 - 37 %

 

HEMATOKRIT

Nilai hematokrit adalah volume eritrosit yang dimampatkan (packed cell volume). Istilah lainnya nilai hematokrit adalah volume sel-sel eritrosit seluruhnya dalam 100ml darah dan dinyatakan dalam %. Berdasarkan atas reprodusibilitas dan sederhananya pemeriksaan tersebut merupakan salah satu pemeriksaan yang paling dapat dipercaya di antara parameter lainnya, yaitu kadar Hb dan hitung eritrosit. Dapat dipergunakan sebagai test penyaring sederhana terhadap anemia.

1. Prinsip Pemeriksaan

Darah dengan antikoagulan diputar di sentrifuge, kemudian dibandingkan panjang kolom merah dengan total kolom.

2. Metode Pemeriksaan

• mikrohematokrit > kapiler


• makrohematokrit > wintrobe

MIKROHEMATOKRIT

Penggunaan tabung hematokrit yang kapasitas dan diameternya lebih kecil dari tabung wintrobe sangat tepat untuk cara pemeriksaan rutin dalam klinik. Disamping itu tabung tersebut dapat dipergunakan untuk penampung darah kapiler secara langsung. Pada anemia makrositik terdapat sedikit kenaikan jumlah plasma, dengan adanya sferofit pada sferosiasis, thalasemia, anemia hipokromik dan anemia sel sabit kenaikan jumlah plasmanya lebih tinggi lagi.

a. Dasar

Darah EDTA atau heparin disentrifuge, sel-sel eritrositnya akan dimampatkan. Tingginya kolom eritrosit diukur dinyatakan dalam % darah tersebut.

b. Alat

• tabung kapiler hematokrit ukuran 75 mm, diameter 1 mm. Ada yang berisi heparin (khusus untuk darah kapiler) dan ada yang tidak berisi antikoagulan (untuk darah antikoagulan, misalnya darah EDTA)


• lampu spiritus / malam untuk menutup salah satu ujung tabung hematokrit


• sentrifuge yang dapat memutar > 16.000 rpm


• skala pembaca mikrohematokrit

c. Reagensia

Heparin (sudah melapisi lumen tabung kapiler)

d. Bahan

Darah vena / darah kapiler

e. Cara Kerja

bila menggunakan darah kapiler

• lakukan pengambilan darah kailer


• isi tabung kapiler dengan darah sampai 3/4 tabung


• sumbat dengan malam ujung tabung yang ada darahnya atau bakar ujung tabung yang tidak ada darahnya (tabung yang kosong) dengan lampu spiritus, hingga benar-benar tertutup.


• sentrifuge dengan kecepatan 16.000 rpm selama 5 menit


• baca dengan skala hematokrit panjang kolom merah


• bila tidak mempunyai skala Ht dipakai perhitungan

Ht =

panjang kolom merah panjang total kolom

x 100%

f. Keuntungan Mikrohematokrit

• cepat


• kesalahan lebih kecil


• mudah


• darah sedikit

g. Sumber Kesalahan

• sentrifugasi tidak benar


• lupa mengocok sample


• penutupan ujung kapiler tidak rapat


• tabung kapiler tidak ditera

MAKROHEMATOKRIT

a. Dasar

Darah antikoagulan disentrifuge pada kecepatan tertentu dan dalam waktu tertentu, perbandingan volume eritrosit terhadap volume specimen darah dinyatakan dalam %

b. Alat

• tabung wintrobe dengan diameter 2,5 - 3,0 mm, panjang 110 mm dan berskala 0 - 10 mm dengan skala terkecil 1 mm. Volumenya 1 ml darah EDAT


• alat sentrifuge

c. Bahan

Darah EDTA, darah heparin

d. Cara Kerja

• dengan menggunakan pipet Pastuer yang berisi darah EDTA, masukan ujung pipet sampai dasar tabung wintrobe


• sambil diangkat, pelan-pelan keluarkan isinya sampai skala teratas


• sentrifuge tabung tersebut pada 3000 rpm selama 30 menit


• tingginya kolom eritrosit adalah nilai hematokrit yang dinyatakan dalam %

e. Nilai Normal

• pria : 47 +/- 7 %


• wanita : 42 +/- 5 %


• Bayi baru lahir : 54 +/- 10 %


• bayi 3 bulan : 38 +/- 6 %


• bayi 3-6 tahun : 40 +/- 4 %


• 10 - 12 tahun : 41 +/- 4 %

 

HITUNG JUMLAH ERITROSIT

Seperti hitung jumlah leukosit, untuk menghitung jumlah sel-sel eritrosit ada 2 metode, yaitu metode manual dan elektronik. Metode manual hampir sama dengan hitung leukosit.

a. Dasar

Untuk memudahkan menghitung eritrosit dan mencegah hemolisis, darah diencerkan dalam larutan isotonis, yang menghancurkan sel-sel lain selain eritrosit.

b. Alat

• alat untuk mengambil darah kapiler atau darah vena


• hemositometer
  
  
  
  • bilik hitung
  
  
  • kaca penutup
  
  
  • pipet eritrosit
    
    
    
    • pipet dengan bola merah
    
    
    • dengan skala 0,5 - 1 - 101
    
    
    
    
  
  
  
  


• mikroskop

c. Reagensia

Larutan hayem yang terdiri atas :

• Na2SO4 kristal 5 gram


• NaCl 1 gram


• HgCl2 0,5 gram


• Aquadest 200 ml

d. Cara Kerja

• Bilik hitung yang telah ditutup dengan kaca penutup diletakkan di mikroskop. Cari kotak kecil (bila menggunakan Neubauer Improve ada di tengah)


• dengan pipet eritrosit pipet darah sampai angka 1 (pengenceran 100x), atau sampai angka 0,5 (pengenceran 200x). Bersihkan ujung pipet.


• pertahankan posisi pipet, hisap larutan hayem sampai angka 101


• bersihkan ujung pipet


• kocok secara horisontal (searah)


• buang tiga tetes pertama


• teteskan ke bilik hitung lewat sela-sela kaca penutup

e. Perhitungan

jumlah eritrosit =

rata-rata jumlah eritrosit X pengenceran volume kotak kecil

f. Nilai Normal

• Pria Dewasa : 4,5 - 6,5 juta / mm3


• wanita dewasa : 3,9 - 5,6 juta / mm3


• bayi < 3 bln : 4,0 - 5,6 juta / mm3


• bayi 3 bulan : 3,2 - 4,5 juta / mm3


• bayi 1 tahun : 3,6 - 5,0 juta / mm3


• anak 12 tahun : 4,2 - 5,2 juta / mm3

LAJU ENDAP DARAH

Kecepatan endap darah atau laju endap darah adalah mengukur kecepatan sedimentasi sel eritrosit di dalam plasma. Satuannya mm/jam. Cara pemeriksaan yang mendapat reomendasi dari International Committee for Standarization in Hematology (ACSH) adalah cara westergen. KED berlangsung dalam 3 tahap. Tahap pertama terdapat penyusunan letak sel-sel eritrosit (reloux formation) dimana kecepatan sedimentasi sangat sedikit. Tahap kedua kecepatan sedimentasi agak cepat dan tahap ketiga kecepatannya sangat rendah.

1. Macam Pemeriksaan Laju Endap Darah

• westergen


• wintrobe. juga dapat mengukur hematokrit sekaligus.


• cutler


• hellige vollmer. Menggunakan darah kapiler

2. Prinsip Pemeriksaan

apabila sejumlah darah diberi antikoagulan diletakkan dalam tabung gelas dalam posisi tegak lurus maka sel-sel akan mengendap, sebaliknya plasma akan bergerak ke atas. Hal ini oleh karena perbedaan berat jenis.

HITUNG JENIS LEUKOSIT

Hitung jenis leukosit dilakukan untuk menetapkan prosentase jenis leukosit yang ada di dalam darah. Pada waktu yang sama juga dilakukan pemeriksaan eritrosit, leukosit, dan trombosit. Di samping itu juga dibuat taksiran kasar terhadap leukosit dan trombosit. Dari pemeriksaan sediaan apus dapat digunakan untuk menaksir kandungan hemoglobin, ukuran, bentuk, dan struktur eritrosit. Hitung jenis leukosit biasanya dilakukan pada sediaan apus yang dibuat pada kaca obyek dengan pewarnaan tertentu. Karena itu perlu diuraikan pembuatan sediaan apus, cara mewarnai serta pemeriksaan dan melaporkan hasil.

1. Alat

• kaca benda / obyek glass yang bersigh


• spreader / penggeser


• pipet darah dan pengaduk


• bak pengecatan


• bak pengeringan


• timer


• gelas ukur

2. Reagensia

• cat rowmanowsky


• wright


• leisman


• may grunwald


• giemsa(induk)


• buffered distilled water pH 7,2 untuk melarutkan cat (buffer sorensen)


• methanol 90%

3. Bahan

Darah vena dan darah kapiler

4. Cara membuat preparat darah hapus

• ambil kaca benda yang bersih, letakan 1 tetes darah disisi kanan


• sentuh tetetsan darah dengan spreader, darah akan melebar sepanjang spreader


• dorong spreader ke arah kiri dengan sudut 45 derajat, keringkan


• amati preparat baik bila : tipis, rata, tidak terputus-putus, ekor tidak boleh robek


• preparat yang sudah kering, genangi dengan methanol 90%, selama 10 menit (beberapa buku menyebutkan cukup 2-3 menit)


• buat larutan giemsa dari giemsa induk dan buffer sorensen dengan perbandingan giemsa 1 bagian, buffer 9 bagian


• preparat yang telah difixasi methanol digenangi larutan giemsa selama 15 menit


• cuci dengan air yang mengalir


• keringkan di udara


• setelah kering dapat diolesi lacquer

5. Rapid Staining

Dalam beberapa keadaan tergesa-gesa kita membutuhkan preparat dalam waktu cepat, dengan rapid staining hal ini dapat dipenuhi. Cara:

• fixasi methanol 90% selama 2-3 menit


• cuci air


• baca dalam keadaan basah.

PEMERIKSAAN HITUNG JUMLAH LEUKOSIT

Hitung leukosit menyatakan jumlah sel-sel leukosit perliter darah (System International Units = SI unit) atau per satu mmk darah. Nilai normalnya 4000 - 11000 / mmk.Untuk penerapan hitung leukosit ada dua metode, manual dan elektronik. Pada umumnya metode elektronik belum digunakan secara umum, mungkin baru di laboratorium besar, sehingga cara manual masih memegang peranan penting. Metode elektronik tidak dibicarakan.

a. Dasar

Darah diencerkan dengan larutan asam lemah, yang menyebabkan sel-sel erotrosit hemolisis serta darah menjadi encer, sehingga sel-sel leukosit mudah dihitung.

b. Peralatan :

1. haemocytometer

• bilik hitung


• pipet leukosit


• pipet eritrosit (untuk menghitung eritrosit)

Bilik Hitung adalah bilik hitung Neubauer Improve atau Burker karena mempunyai daerah perhitungan yang luas.

burker : luas seluruh bilik : 3x 3 mm2. di dalam bilik terdapat :

• kotak besar : 1 x 1 mm2


• kotak sedang : 1/5 x 1/5 mm2


• kotak kecil : 1/20 x 1/20 mm2

Neubauer Improve : luas seluruh bilik 3 x 3 mm2. tinggi/dalam 0,1 mm. di dalam bilik terdapat :

• kotak besar : 1 x 1 mm2


• kotak sedang ada 2 macam :
  
  
  
  • di tengah : 1/5 x 1/5 mm2
  
  
  • di empat sudut : 1/4 x 1/4 mm2
  
  
  
  


• kotak kecil : 1/20 x 1/20 mm2

pipet leukosit didalamnya terdapat bola berwarna putih, mempunyai garis 0,5 - 1 - 11

2. kaca penutup

3. mikroskop

c. Larutan pengencer yang dapat digunakan salah satunya larutan truk

• asam asetat glacial 2 ml


• gentian violet 1 ml


• aquades 100 ml

d. Spesimen

Darah vena atau darah kapiler

e. Cara Kerja

• Bilik hitung dicari dengan menggunakan mikroskop, cari kotak sedang di tempat ujung bilik hitung


• hisap darah dengan pipet leukosit sampai angka 1 (pengenceran = 10x) atau sampai angka 5 (pengenceran = 20x)


• hapus darah yang melekat pada ujung pipet


• kenudian dengan pipet yang sama hisap larutan truk sampai angka 11


• campur (kocok) secara horisontal


• buang tetesan pertama


• tuangkan dalam bilik hitung yang telah ditutup dengan kaca penutup dan diletakkan di mikroskop


• lakukan perhitungan sel leukosit dengan perbesaran obyektif 10 atau 40 x.

f. Perhitungan

jumlah leukosit =

rata-rata jumlah leukosit tiap kotak X pengenceran volume tiap kotak

g. Nilai Normal menurut Dacie

• dewasa pria : 4 - 11 ribu/mmk


• dewasa wanita : 4 - 11 ribu/mmk


• bayi : 10 -25 ribu/mmk


• 1 tahun: 6 - 18 ribu/mmk


• 12 tahun : 4,5 - 13 ribu/mmk

PENETAPAN KADAR HEMOGLOBIN

Hemoglobin dapat ditetapkan dengan berbagai cara, antara lain metode sahli, metode oksihemoglobin, atau metode sianmethemoglobin. Metode sahli tidak dianjurkan karena mempunyai kesalahan yang besar, alatnya tidak dapat distandarisasi, dan tidak semua jenis hemoglobin dapat ditetapkan sebagai contoh karboksihemoglobin, methemoglobin, dan sulfahemoglobin.

Hanya ada 2 metode yang dapat diterima dalam hemoglobinometri klinik, yaitu oksihemoglobin, dan sianmethemoglobin. Keduanya merupakan cara spektrofotometrik. Metode oksihemoglobin hanya mengukur semua hemoglobin yang dapat diubah menjadi oksihemoglobin, sedang karboksihemoglobin dan senyawa hemoglobin yang lain tidak terukur.

Internasional Committe for Standarization in Hematology (ICSH) merekomendasikan metode sianmethemoglobin, sebab selain mudah dilakukan juga mempunyai standar yang stabil dan hampir semua jenis hemoglobin terukur kecuali sulfahemoglobin.

1. Metode Sahli

a. Dasar

Metode sahli merupakan satu cara penetapan hemoglobin secara visual. Darah diencerkan dengan larutan HCl sehingga hemoglobin berubah menjadi hematin asam. Untuk dapat menentukan kadar hemoglobin dilakukan dengan mengencerkan larutan campuran tersebut dengan aquadest sampai warnanya sama dengan warna batang gelas standar.

b. Peralatan dan Pereaksi

• alat untuk mengambil darah vena atau darah kapiler


• hemometer sahli, yang terdiri atas
  
  
  
  • tabung pengencer. panjang 12cm, dinding bergaris mulai angka 2(bawah) s/d 22(atas)
  
  
  • dua tabung standar warna
  
  
  • pipet Hb. dengan pipa karet panjang 12,5 cm terdapat angka 20
  
  
  • pipet HCl
  
  
  • botol tempat aquadest dan HCl 0,1N
  
  
  • batang pengaduk (dari glass)
  
  
  • larutan HCl 0,1N
  
  
  
  


• aquadest

c. Spesimen

Dapat berupa darah kapiler atau darah vena (darah EDTA)

d. Cara Kerja

• isi tabung pengencer dengan HCl 0,1N sampai angka 2


• dengan pipet Hb, hisap darah sampai angka 20 mm, jangan sampai ada gelembung udara yang ikut terhisap


• hapus darah yang ada pada ujung pipet dengan tissue


• tuangkan darah ke dalam tabung pengencer, bilas dengan aquadest bila masih ada darah dalam pipet


• biarkan satu menit


• tambahkan aquadest tetes demi tetes, aduk dengan batang kaca pengaduk


• bandingkan larutan dalam tabung pengencer dengan warna larutan standar


• bila sudah sama penambahan aquades dihentikan, baca kadar Hb pada skala yang ada ditabung pengencer

e. Nilai Normal menurut Dacie

• dewasa laki-laki : 13,5 - 18,0 gr%


• dewasa wanita : 11,5 - 16,5 gr%


• bayi (< 3bln) : 13,6 - 19,6 gr%


• umur 1 tahun : 11,0 - 13,0 gr%


• umur 12 tahun :11,5 - 14,8 gr%

f. Sumber Kesalahan

• tidak semua hemoglobin berubah menjadi hematin asam seperti karboksihemoglobin, methemoglobin, sulfahemoglobin.


• cara visual mempunyai kesalahan inheren 15-30%, sehingga tidak dapat untuk menghitung indeks eritrosit.


• sumber kesalahan yang sering terjadi :
  
  
  
  • kemampuan untuk membedakan warna tidak sama
  
  
  • sumber cahaya yang kurang baik.
  
  
  • kelelahan mata
  
  
  • alat-alat kurang bersih
  
  
  • ukuran pipet kurang tepat, perlu dikalibrasi
  
  
  • pemipetan yang kurang akurat
  
  
  • warna gelas standar pucat / kotor dan lain sebagainya
  
  
  • penyesuaian warna larutan yang diperiksa dalam komparator kurang akurat.
  
  
  
  

2. Metode Oksihemoglobin

metode yang paling sederhana dan tercepat dalam fotometri. Tetapi keterandalan ini tidak dipengaruhi oleh kenaikan bilirubin plasma. Kerugiannya standar oksihemoglobin tidak stabil.

a. Dasar

Darah dicampur dengan larutan Natrium Karbonat 0,1% atau amonium hidroksida dan dikocok terjadi oksihemoglobin, intensitas warnanya diukur secara spektofotometrik.

b. Peralatan dan Pereaksi

• Na-Karbonat 0,1% atau NH4OH 0,04%


• pipet ukur 5 ml


• mikropipet 20 mikroliter


• tabung reaksi ukuran 75X10mm


• spektofotometer.

c. Cara Kerja

• siapkan tabung reaksi yang berisi 5 ml larutan Na-Karbonat 0,1%


• tambahkan EDTA atau Darah kapiler 20 mikro, bilaslah mikropipet yang digunakan, paling sedikit 3 kali.


• tutuplah tabung reaksi tersebut dan kocoklah 10 detik. baca serapan dengan spektrofotometri pada 540 nm


• baca kadar hemoglobinnya pada kuvet kalibrasi yang telah dipersiapkan sebelumnya.

3. Metode Sianmethemoglobin

a. Dasar

ferrosianida mengubah besi pada Hb dari bentuk ferro ke bentuk ferri menjadi methemoglobin yang kemudian bereaksi dengan KCN membentuk pigmen yang stabil yaitu sianmethemoglobin. Intensitas warna yang terbentuk yang diukur fotometrok 540 nm. Kalium-hidrogen-fosfat digunakan agar pH tetap di mana reaksi dapat berlangsung sempurna pada saat yang tepat. Deterjen berfungsi mempercepat hemolisa darah serta mencegah kekeruhan yang terjadi oleh protein plasma.

b. Peralatan dan Pereaksi

• mikropipet 20 mikroliter / mmk atau pipet Sahli


• pipet volumetrik 5 ml


• tabung reaksi ukuran 75 x 10mm


• spektrofotometer/kolorimeter dengan panjang gelombang 540 nm


• larutan Drabkin atau modifikasinya (diperdagangkan dalam bentuk kit), yang berisi kandungan :
  
  
  
  • kalium ferrosianida 200mg
  
  
  • KCN 50 mg
  
  
  • Kalium Hydrogen fosfat 140 mg
  
  
  • detergen 0,5-1 ml
  
  
  • aquadest / detenized water ad. 1000 ml
  
  
  
  

c. Spesimen

Darah kapiler atau darah EDTA

d. Cara Kerja

• ke dalam tabung reaksi 75 x 10 mm, pipetkan 5 ml pereaksi


• dengan mikropipet tambahkan 20mikroliter / mmk darah penderita ke dalam pereaksi tersebut serta hindarilah terjadinya gelembung dan bersihkan bagian mikropipet.


• campurkan isinya dan iarkan pada suhu kamar selama 3-5 menit dan serapannya dibaca dalam spektrofotometri pada panjang gelombang 540nm dengan pereaksi sebagai blangko


• kadar hemoglobin dapat dibaca pada kurva kalibrasi atau dihitung dengan menggunakan faktor; dimana kadar Hb = serapan x faktor kurva kalibrasi dan faktor telah dipersiapkan sebelumnya.

e. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Perhitungan faktor.

Sebelum fotometer dipergunakan untuk penetapan kadar hemoglobin, harus dikalibrasi dulu, atau dihitung faktornya. Untuk keperluan tersebut dipergunakan larutan standart hemisianida (sianmethemoglobin) dan pengenceran larutan tersebut dalam pereaksi Drapkin. Kadar Hb dari larutan standart hemisianida dapat dihitung dalam gr/100ml atau gr/dl sebagai berikut :

Kadar HbLarutan Standart =

Kadar hemisianida mg/dl 1000/100

X (500 + 20) mikroliter 20 mikroliter

= kadar hemisianida X 0,251 mg/dl

Buatlah pengenceran larutan standar 100, 75, 50, 25, dan 0% sebagai blanko dengan larutan Drapkin. Setelah masing-masing tercampur sempurna biarkan pada suhu kamar 3 menit dan baca serapan pada fotometer dengan 540 nm. Buatlah kurvanya dengan kadar Hb sebagai absisi dan serapan sebagai ordinat, maka hasil percobaan serapan pasien tinggi memplotkan pada kurva tera. Atau menggunakan factor sebagai berikut :

Faktor (F)

=

Jumlah Kadar Hb Jumlah Serapan

f. Pengawasan Mutu

Hemolisat yang dipergunakan atau dibuat sendiri dengan standar hemosianida, CV optimal = 3% dan CV tidak boleh lebih dari 6%

g. Sumber Kesalahan

• terjadinya jendalan darah


• darah yang hipemik menyebabkan hasilnya lebih tinggi dari seharusnya.


• leukositosis berat mempengaruhi pengukuran lebih rendah dari seharusnya


• kerusakan pereaksi


• pemipetan yang tidak akurat


• fotometer yang kurang baik